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    • 专利摘要:
    Eswerden Verfahren zur verbesserten Kultivierung des Pilzes Penicilliumchrysogenum, insbesondere Stamm KIP 3201, zur optimierten Produktion desantitumoralen Naturstoffes Sorbicillacton A (2) und Derivaten davonin großenMengen sowie optimierte Verfahrenzu dessen Gewinnung und Aufreinigung aus der Pilzbiomasse und ausdem Kulturmedium beschrieben. Weiterhin werden die biologische Aktivität von SorbicillactonA (2) und Untersuchungen zur Genotoxizität der Verbindung beschrieben.
    公开号:DE102004004901A1
    申请号:DE102004004901
    申请日:2004-01-30
    公开日:2005-08-25
    发明作者:Gerhard Bringmann；Tobias Gulder；Johann Imhoff；Gerhard Lang；Werner E.G. Müller；Sanja Perovic-Ottstadt；Karsten Schaumann；Rolf Schmaljohann；Rüdiger Stöhr；Jutta Wiese
    申请人:Johannes Gutenberg-Universitaet Mainz；Julius-Maximilians-Universitaet Wuerzburg；
    IPC主号:A61K31-343
    专利说明:
    [0001] Dievorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur optimierten Herstellungder biologisch aktiven Verbindung Sorbicillacton A und Derivatendavon durch Anzucht von Penicillium chrysogenum, insbesondere StammKIP 3201. Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur AufreinigunggroßerMengen an Sorbicillacton A und Derivaten davon aus dem Kulturmediumund der Pilzbiomasse sowie die Verwendung von Sorbicillacton A zurBehandlung von Erkrankungen und Infektionen.
    [0002] DieSuche nach neuen biologisch aktiven Verbindungen erfolgt vor allemauf zwei Wegen. Die Isolierung aktiver Naturstoffe aus biologischenSystemen auf der einen Seite, sowie die Synthese neuartiger Verbindungen,zum Teil inspiriert von Sekundärmetabolitenaus der Natur, auf der anderen. Besonders interessant ist dabeidie Untersuchung der Metaboliten von Makro- und Mikroorganismenin schwer zugänglichenund extremen Lebensräumen.So stellen beispielsweise marine eukaryontische Organismen, speziellSchwämme, einereiche Quelle bioaktiver Substanzen dar (Sarma AS, Daum T, Müller WEG(1993) Secondary metabolites from marine sponges. Akademie gemeinnütziger Wissenschaftenzu Erfurt, Ullstein-Mosby Verlag, Berlin). Grund hierfür ist diesessile Lebensweise dieser Organismen. Sie sind auf den Herantransportihrer Nahrung, schwebende Partikel (Algen, Bakterien oder Pilze)im Wasser, angewiesen. Diese Partikel werden über einen ständigen Wasserstromeingestrudelt. Dies führtzu einer erhöhtenGefahr der Erkrankung an Bakterien- oder Pilzinfektionen. Schwämme sindaus diesem Grund auf effiziente Abwehrmechanismen zum Schutz vorderartigen Infektionen durch biologisch aktive Sekundärmetaboliteangewiesen. Es bleibt allerdings häufig unklar, ob diese Substanzenvom Schwamm selbst, oder von einem der zahlreichen mit dem Schwammassoziierten Mikroorganismen gebildet werden. Es ist daher besondersinteressant, diese im Schwamm lebenden Mikroorganismen zu isolierenund deren Metabolitenspektrum zu untersuchen. Folglich ist es einHauptziel der Forschung, Methoden zu entwickeln, die es ermöglichen,diese Mikroorganismen in Kultur zu züchten, um deren biologischaktiven Sekundärmetabolitein ausreichenden Mengen verfügbarzu machen.
    [0003] Heutekann angenommen werden, daß lediglichetwa 5 % der in marinen eukaryontischen Organismen vorkommendenMikroorganismen kultivierbar sind. Folglich kann davon ausgegangenwerden, daß deren Potentialnoch weitgehend ungenutzt ist. Zur erfolgreichen und nachhaltigenNutzung dieser Mikroorganismen als Quellen neuer Pharmazeutika istes wichtig, Kultivierungsmethoden zu entwickeln, die sich dadurchauszeichnen, daß dieProduktion der gewünschtenMetaboliten möglichststark gesteigert wird, währenddie Bildung der unerwünschtenNebenprodukte weitgehend unterbunden wird.
    [0004] DasAnwendungsspektrum füreine kommerzielle Nutzung der bioaktiven Sekundärmetabolite ist breit und reichtvon der Behandlung neurodegenerativer Erkrankungen, bakterieller,viraler und fungaler Infektionen bis hin zur Therapie von Tumoren.
    [0005] Intensivwird dabei auch nach solchen bioaktiven Substanzen gesucht, dieeine hohe Spezifitätgegen definierte Tumoren entfalten und gleichzeitig opportunistischeInfektionen, z. B. durch Viren, eindämmen.
    [0006] Diebioaktive Substanz Sorbicillacton A und Derivate davon wurden kürzlich auseinem Penicillium-Stamm isoliert, der aus einem marinen Schwammder Gattung Ircinia isoliert wurde ( DE102 38 257.3 ). Es wurde dabei gefunden, daß SorbicillactonA und Derivate davon nicht vorhersehbare ausgeprägte antitumorale und antiviraleals auch entzündungshemmendeEigenschaften aufweisen. Eine Hochskalierung der bisher verwendetenVerfahren zur Herstellung dieser Substanz und ihrer Derivate warbisher nicht möglich.Allerdings ist die zuverlässigeHerstellung von großenMengen an Sorbicillacton A und Derivaten davon für die vielversprechende Verwendungin der Behandlung von Erkrankungen, wie beispielsweise von Krebsund Entzündungen, dringendnotwendig.
    [0007] Esist daher die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahrenzur optimierten Produktion des Naturstoffes Sorbicillacton A undDerivaten davon, sowie zur Extraktion von Sorbicillacton A und Derivatendavon aus dem Kulturmedium und der Pilzbiomasse und zur AufreinigunggroßerMengen an Sorbicillacton A und Derivaten davon zur Verfügung zustellen.
    [0008] Erfindungsgemäß wird dieseAufgabe zunächstdurch das Bereitstellen eines Verfahrens gelöst, das die folgenden Schritteumfaßt: a) Anzüchteneines Pilzes der Gattung Penicillium bei 20–25 °C in einem geeigneten Anzuchtmediumbei einer Salzkonzentration von 2–5 % bis zum Ausbilden eineskompakten Oberflächenmycels, b) Erhöhender Temperatur auf 28–35°C und weiteresInkubieren für5–10 Tage, c) Abtrennen der Kulturflüssigkeitvom Mycel, und d) Extrahieren von Sorbicillacton A und Derivaten davon ausdem Kulturmedium, und gegebenenfalls, e) Unterschichten des Mycels mit frischem Medium mit einer verringertenSalzkonzentration von 0,5–1,5% und Inkubieren bei 28–35°C für 3–8 Tage, f) Wiederholen von Schritt c) und d), und gegebenenfalls, g) Wiederholen der Schritte e) bis f), und h) Extrahieren von Sorbicillacton A und Derivaten davon ausdem Kulturmedium und/oder den Mycelien.
    [0009] Erfindungsgemäß handeltes sich somit um ein Verfahren, bei dem das Anzüchten des Pilzes unter besonderenBedingungen erfolgt, die eine erhöhte Ausbeute und gleichzeitigerhöhteProduktionsraten bewirken. So werden Wachstum und Produktion vonSorbicillacton A sowie Vorstufen bzw. Derivaten davon durch dieVariation der Kulturbedingungen gesteuert und z. B. durch Zugabevon NaCl initiiert und stimuliert. Insbesondere wird die Produktiondadurch beschleunigt, daß inStufenprozessen Bedingungen füroptimales Wachstum und optimale Produktionsbedingungen nacheinanderrealisiert werden, z. B. durch einen Wechsel der Inkubationstemperaturvon beispielsweise 20–25°C auf 28–35°C und einenWechsel der Salzkonzentration von 2–5 % auf 0.5–1.5 %.Bei anderen Inkubationstemperaturen wurde gar keine oder nur geringeProduktion von Sorbicillacton A und/oder Derivaten davon gefunden. Überraschenderweisestellt das Verfahren der vorliegenden Erfindung somit zuverlässig große Mengenan Sorbicillacton A und Derivaten davon zur Verfügung.
    [0010] Erfindungsgemäß bevorzugtist ein Verfahren, wobei der Pilz Penicillium chrysogenum, insbesondere derStamm KIP 3201, zur Produktion verwendet wird.
    [0011] Ineinem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung handelt es sichum ein Verfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, daß eine Erhöhung derAusbeute an Sorbicillacton A dadurch erreicht wird, daß die Anzuchtmediendurch Variation der Substrate und Substratkonzentrationen, wie z.B. durch Zugabe von Pyruvat, Glutamat, Prolin und Acetat, aber auchvon Sorbicillin und anderen biosynthetischen Vorstufen von SorbicillactonA, verändertwerden.
    [0012] Ineiner bevorzugten Ausführungsformhandelt es sich um ein Verfahren, in dem die Produktion von SorbicillactonA und Derivaten davon im Flachbettverfahren erfolgt. Eine Produktionvon Sorbicillacton A und Derivaten davon kann weiterhin dadurchbeschleunigt werden, daß zugeeigneten Zeitpunkten die flüssige Phasevon den Zellen getrennt wird und die Zellen mit frischem Mediumversorgt erneut zur Produktion angeregt werden. Geeignete Zeitensind beispielsweise 3–10Tage.
    [0013] Bevorzugtwird eine Art des Inokulums in Form einer Festkörper-gebundenen Form des Pilzes,dessen Animpfmaterial auf schwimmfähigen Festkörpern, z. B. Getreidekörnern oderStyroporkugeln, dargeboten wird.
    [0014] Weiterhinbevorzugt wird ein Verfahren, wobei ein Absinken des Oberflächenpilzmycelsverhindert wird. Das kann dadurch erfolgen, daß eine Trägervorrichtung zur Stabilisierungdes Oberflächenmycelsin die Anzuchtbehälterintegriert wird. Eine geeignete Form einer Trägervorrichtung stellt dabeibeispielsweise ein Netz dar.
    [0015] Einbevorzugtes Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß das produzierteSorbicillacton A und Derivate davon, unmittelbar aus den Kulturmedienan einen festen Austauscher gebunden werden. Aus dieser gebundenenForm erfolgt dann eine Aufreinigung in weiteren Schritten. Dabeikann die Elution vom Austauscher mit organischen Lösungsmitteln,wie Methanol, Ethanol, Ethylacetat, Heptan oder Acetonitril, erfolgen. Aufdiese Weise kann Sorbicillacton A und Derivate davon in hochangereicherterForm vom Austauscher gewonnen werden.
    [0016] Einweiteres bevorzugtes Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß das produzierteSorbicillacton A und Derivate davon aus dem Pilzmycel, das vom Kulturmediumabgetrennt wurde, durch Versetzen mit organischen Lösungsmittelnextrahiert werden. Dabei wird bevorzugt Ethylacetat verwendet.
    [0017] Ineinem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung handelt es sichum ein Verfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, daß eine weitereExtraktion der Rohextrakte durchgeführt wird. Dabei können dieRohextrakte angesäuertund anschließendSorbicillacton A und Derivate davon mittels organischen Lösungsmitteln extrahiertwerden. Dabei wird ebenfalls bevorzugt Ethylacetat verwendet.
    [0018] Weiterhinist es vorteilhaft, eine optimierte Aufreinigung der Extrakte mittelsFast Centrifugal Partitioning Chromatography (FCPC) durchzuführen. Weiterhinwird eine optimierte Aufreinigung der Extrakte mittels Gelchromatographie,z. B. an Sephadex LH-20,bevorzugt. Dabei könnenverschiedene organische Lösungsmittelzur Elution von Sorbicillacton A und Derivaten davon verwendet werden.
    [0019] Einbevorzugter Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren,das dadurch gekennzeichnet ist, daß es eine Derivatisierung vonSorbicillacton A zum Sorbicillacton-A-methylester umfaßt.
    [0020] Eswurde gefunden, daß neuronaleZellen, die mit Sorbicillacton A inkubiert wurden, nach Zugabe von L-Glutaminsäure undSerotonin (5-HT) einen starken Abfall des intrazellulären Kalziumspiegelszeigten. L-Glutaminsäureund Serotonin sind als Neurotransmitter in einer Reihe von neurodegenerativenErkrankungen etiologisch involviert. Aufgrund dieser EigenschaftenkönntenSorbicillacton A oder Derivate davon in der Behandlung neurodegenerativerErkrankungen und der damit verbundenen Symptom-Komplexe verwendetwerden.
    [0021] Weiterhinwurde die Genotoxizitätvon Sorbicilllacton A an L5178Y-Mäuselymphomazellen(ATCC CRL 1722) getestet. Es wurde gefunden, daß in Zellen, die mit 1, 3 und10 μg/mLSorbicillacton A inkubiert wurden, keine DNS-Strangbrüche induziertwurden. Dagegen wurde ein signifikanter Anstieg des Anteils der DNS-Strangbrüche nach24 Stunden Inkubation bei einer Konzentration von 30 μg/mL SorbicillactonA gefunden. Aufgrund dieser Eigenschaften ist es vorteilhaft, SorbicillactonA oder Derivate davon in der Behandlung von Leukämie zu verwenden.
    [0022] Auchinduziert Sorbicillacton A in L5178Y-Zellen nach 4 Stunden Inkubationbei einer Konzentration von 10 und 30 μg/mL Apoptose. Aufgrund dieserEigenschaften wird die Verwendung von Sorbicillacton A oder Derivatendavon in der Behandlung von Leukämiebevorzugt.
    [0023] WeiterhinkönnenSorbicillacton A oder Derivate davon bei der Behandlung viraler;Infektionen angewendet werden. Einzelheiten dazu sind in den Beispielender DE 102 38 257.3 beschrieben.
    [0024] Einweiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft Verfahren zurHerstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, wobei SorbicillactonA oder Derivate davon zusammen mit geeigneten pharmazeutisch akzeptablenHilfs- und Zusatzstoffe formuliert werden. Bevorzugt werden dabeipharmazeutische Zusammensetzungen, in denen Sorbicillacton A oderDerivate davon in einer Menge vorliegen, daß ein Konzentrationsbereichzwischen 0,3 und 30 μg/mlbei der Behandlung in vivo vorliegt.
    [0025] Einweiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft den Pilzstammder Gattung Penicillium chrysogenum KIP 3201. Dieser wurde am 14.Januar 2004 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und ZellkulturenGmbH unter der Nummer DSM 16137 hinterlegt.
    [0026] ImRahmen der vorliegenden Erfindungen soll unter einem "Derivat" eine von der allgemeinenFormel 1 abgeleitete Verbindung sein, die zum Beispiel durch verschiedeneder fürR1 bis R4 und Xoder Y angegebenen Restgruppen substituiert ist, sowie Gemischeverschiedener dieser Verbindungen, die zum Beispiel zu einem aufdie jeweils zu therapierende Erkrankung und/oder des Patienten aufBasis von diagnostischen oder Daten über den Behandlungserfolg oder-verlauf abgestimmten "personalisierten" Medikament verarbeitet werdenkönnen.Unter einem Derivat wird auch eine Verbindung der Sorbicillacton-A-Klasseverstanden, die aus anderen (z.B.) marinen Organismen isoliert werdenkann, als den hier (beispielhaft) erwähnten.
    [0027] Dievorliegende Erfindung soll nun im weiteren durch die folgenden Beispielein Bezug auf die beiliegenden Abbildungen beschrieben werden, ohnejedoch darauf beschränktzu werden. Es zeigt
    [0028] 1 denEinfluß vonSorbicillacton A auf den intrazellulären Kalziumspiegel von neuronalenZellen.
    [0029] 1A zeigt die Behandlung von Neuronen mit200 μM L-Glutaminsäure (L-Glu)und 2,5 mM Ca2+ (•), wobei die Neuronen, diemit 10 μg/mLSorbicillacton A (o) behandelt wurden, 5 min vor Zugabe von 200 μM L-Glu und2,5 mM CaCl2 (zum Zeitpunkt 10 min) präinkubiertwurden. Die Änderungskinetikwurde kontinuierlich überetwa 20 min gemessen. Es wurden sowohl Mittelwert (n = 19) als auchStandardabweichung (± SE) ermittelt.
    [0030] 1B zeigtdie Behandlung von Neuronen mit 200 μM Serotonin (5-HT) und 2,5 mMCa2+ (•),wobei die Neuronen, die mit 10 μg/mLSorbicillacton A (o) behandelt wurden, 5 min vor Zugabe von 200 μM 5-HT und 2,5mM CaCl2 (zum Zeitpunkt 10 min) präinkubiertwurden. Die Änderungskinetikwurde kontinuierlich über etwa20 min gemessen. Es wurden sowohl Mittelwert (n = 21) als auch Standardabweichung(± SE)ermittelt.
    [0031] 2 dieErgebnisse des "Comet-Assay" nach der Inkubationvon L5178Y-Mäuselymphomazellen (ATCCCRL 1722) mit 1, 3 und 10 μg/mLSorbicillacton A.
    [0032] 2A zeigt die Ergebnisse nach 4 StundenInkubationszeit. 2B zeigt die Ergebnissenach 24 Stunden Inkubationszeit. Es wurden jeweils der Mittelwert(A: n = 25, B: n = 29) und die Standardabweichung (± SD) ermittelt.
    [0033] 3 dieErgebnisse des "FastMicroassay" nachder Inkubation von L5178Y-Mäuselymphomazellen (ATCCCRL 1722) mit 1, 3, 10 und 30 μg/mLSorbicillacton A.
    [0034] 3A zeigt die Ergebnisse nach 4 StundenInkubationszeit. 3B zeigt die Ergebnissenach 24 Stunden Inkubationszeit. Es wurden jeweils der Mittelwert(A: n = 5, B: n = 7) und die Standardabweichung (± SD) ermittelt.
    [0035] ZurOptimierung der Produktion von Sorbicillacton A wurden Medien undKulturbedingungen etabliert, die sich von den sonst üblichenunterscheiden, u.a. dadurch, daß beierhöhtenSalzgehalten und Temperaturen, die für diesen Organismus ungewöhnlich sind,kultiviert wird.
    [0036] AlsInokulum fürdie Anzucht werden unter Standardbedingungen erstellte Sporensuspensionenverwendet, die zunächstauf Agarplatten mit Wickerham Medium mit 1,5 % Bactoagar bei Raumtemperaturfür 14 Tageangezogen werden. Die Sporen werden in einer Lösung von Meerwasser (34‰) undGlycerin (2:1) suspendiert, auf einen Standardtiter eingestellt,portioniert und in geeigneten Portionen eingefroren und bei –20°C gelagert.Das Animpfgut fürgroßeAnsätzevon Massenkulturen wird hergestellt, indem Getreidekörner durch Autoklavierensterilisiert, mit Medium versetzt und mit Pilzsporen beimpft werden.Nach Inkubationszeit von 14 Tagen bei 20°C werden die Körner getrocknetund bis zur Verwendung bei Raumtemperatur gelagert. Mit diesen Sporenpräparationenwerden die Kulturmedien angeimpft.
    [0037] Für die Produktionwird eine modifizierte Version des Wickerham'schen Mediums in der folgenden Zusammensetzungverwendet: 3 g Hefeextrakt, 6 g Malzextrakt, 5 g Pepton, 10 g Glukose,25 g NaCl in 1000 mL aqua dest. Der pH-Wert wird auf 5.5 eingestellt.
    [0038] DasMedium wird in Kulturgefäßen miteiner Füllhöhe von 4cm gegeben, autoklaviert (20 min. bei 121 °C), nach Abkühlen mit Sporensuspension beimpftund für7 Tage bei 22°Cbis zur Ausbildung eines kompakten Oberflächenmycels inkubiert. Dannwird die Temperatur auf 31 °Cerhöhtund fürweitere 7 Tage inkubiert. Dann wird die Kulturflüssigkeit, die den überwiegendenAnteil des produzierten Sorbicillactons (1) enthält vom Mycel getrennt und zurSubstanzgewinnung weiter aufbereitet. Das Mycel wird erneut mitder gleichen Menge an frischem Medium etwas veränderter Zusammensetzung unterschichtet.Verwendet wird das Medium, wie oben aufgeführt, jedoch mit 5 g NaCl, 15g Glucose pro Liter und ohne Malzextrakt. Das Medium wird vor dem Befüllen aufInkubationstemperatur aufgewärmtund die Mycelien werden für5 Tage inkubiert. Danach wird die gleiche Prozedur wiederholt. SorbicillactonA (1) wird aus den Kulturflüssigkeitenund den Mycelien nach getrennten Verfahren extrahiert.
    [0039] DasPilzmycel wird vom Kulturmedium durch ein feinmaschiges Netz getrennt,mit 3 mL Ethylacetat je Gramm Biomasse versetzt und extrahiert.Die Extrakte werden filtriert und am Rotationsverdampfer eingeengt. DasKonzentrat wird bei 5°Cbzw. –20°C bis zurweiteren Aufreinigung gelagert.
    [0040] Zudem vom Mycel getrennten Kulturmedium werden je Liter 100 g einesAustauscherharzes, z.B. XAD-16, unter leichtem Rühren zugegeben. Das XAD-16wird nach dem Beladen mit den Substanzen aus dem Medium abfiltriertund nacheinander mit Methanol/Wasser (1:1) und Methanol extrahiert.Der Extrakt wird am Rotationsverdampfer eingeengt und das methanolfreieKonzentrat wird bei 5°Cbzw. – 20°C bis zurweiteren Aufreinigung gelagert.
    [0041] DieGehaltsbestimmung erfolgt auf einer analytischen HPLC mit Diodenarray-Detektor(Gradient: 80 % A : 20 % B auf 20 % A : 80 % B in 20 min. mit A= Wasser + 0.05 % TFA und B = Acetonitril + 0.05 % TFA) an einerWaters Symmetry-C-18 reversed-phase-Säule beieinem Fluß von0.4 mL/min. Die Integration der Peakfläche wird bei einer Wellenlänge von370 nm durchgeführt,da die Absorption von Dihydrosorbicillacton A (3) bei dieser Wellenlänge praktischgleich null ist, und somit der Fehler bei der Gehaltsbestimmungminimiert wird. Die Bestimmung der Konzentration in den Rohextraktenerfolgt durch Verdünnungdes jeweiligen Extraktes mit einem Methanol-/Wassergemisch (1:1)um den Faktor 150, bei den Extrakten der verschiedenen Aufreinigungsstufenbei einer Verdünnungum den Faktor 10. Die Bestimmung des Gehaltes an Sorbicillacton A(2) sowohl in den Rohextrakten als auch in den einzelnen Extraktender verschiedenen Aufreinigungsstufen geschieht mit Hilfe einerEichgerade aus Messungen mit Proben verschieden konzentrierter Lösungen von SorbicillactonA (2) in Methanol.
    [0042] DerwässrigeRohextrakt der Pilzkulturen von Penicillium chrysogenum wird zurAbtrennung unerwünschterNebenprodukte, wie zum Beispiel Meleagrin, mit Ethylacetat neutralextrahiert. Die erhaltene Ethylacetat-Phase wird verworfen. DiewässrigePhase wird mit Phosphorsäureangesäuert(pH = 2) und mit Ethylacetat erschöpfend extrahiert. SorbicillactonA kann praktisch quantitativ in die Ethylacetat-Phase der sauren Extraktion überführt werden.Der gewonnene Extrakt enthältnach Einengen im Vakuum bereits einen Massengehalt von bis zu 50% Sorbicillacton A.
    [0043] Dieweitere Aufreinigung des Extraktes erfolgt mit einem zusätzlichenflüssig-flüssig-chromatographischenSchritt. Dabei kommt die neuartige Methode der so genannten FastCentrifugal Partitioning Chromatography (FCPC) zur Anwendung. Beidieser Methode wird, wie bei gängigenflüssig-flüssig-chromatographischenMethoden, wie zum Beispiel der High Speed Countercurrent Chromatography(HSCCC), ein 2-phasiges Lösungsmittelgemischeingesetzt. Dabei kann wahlweise die obere oder die untere Phaseals stationärePhase verwendet werden. Anders als bei der HSCCC wird bei der FCPCnicht mit einer Kapillarspule, sondern mit einem mit mehreren hundert Trennkammernversehenen Rotor gearbeitet. In diesen direkt hintereinander geschaltetenKammern findet die Verteilung der im Extrakt enthaltenen Substanzenzwischen mobiler und stationärerPhase statt.
    [0044] DasSystem wird währendder Trennung in schnelle Rotation versetzt (1200–1400 rpm). Dadurch wird zumeinen, je nach Durchflußrichtung,die gewünschtePhase im Rotor der FCPC zurückgehaltenund zum anderen die Trennung der beiden Phasen durch die Zentrifugalkraftbeschleunigt. Dies ermöglichtdie Verwendung großerFlußgeschwindigkeitenund somit den Durchsatz großerSubstanzmengen in kurzer Zeit. Der Verteilungskoeffizient K dergewünschtenSubstanz zwischen den beiden Phasen sollte im Bereich zwischen 0,7 und4,5 liegen. Bei kleinerem K eluiert die Substanz zu schnell, sodaß keinerleiTrennung erfolgt. Bei höherem Khingegen wird die Retentionszeit für die schnelle AufreinigunggroßerMengen Extrakt zu lang.
    [0045] ImFall von Sorbicillacton A ist die Verwendung eines Lösungsmittelgemischesaus Heptan/Ethylacetat/Methanol/Wasser (42 %/58 %/42 %/58 %) beieinem Fluß von6 bis 7 mL pro min., einer Umdrehungszahl von 1200 rpm und der Verwendungder oberen Phase als stationärerPhase besonders vorteilhaft. Pro Liter Lösungsmittelgemisch wird außerdem 1mL konzentrierte Phosphorsäurezugesetzt. Bei Verwendung eines 200 mL fassenden FCPC-Rotors isteine Aufreinigung von bis zu 1,5 g Extrakt pro Lauf möglich. ProTrennung werden mit diesen Einstellungen inklusive Vorbereitungs-und Spülzeitenlediglich 90 min benötigt.Die Sorbicillacton A enthaltenden Fraktionen werden von den organischenLösungsmittelnbefreit und die zurückbleibende,wässrig-saurePhase erschöpfendmit Ethylacetat extrahiert. Nach Einengen im Vakuum erhält man Extraktemit einem Massengehalt an Sorbicillacton A von bis zu 70 %.
    [0046] Derbei der Gewinnung von reinem Sorbicillacton A (2) schwierigste Schrittist die Abtrennung der strukturell sehr ähnlichen, aber um das Fünffacheweniger aktiven Verbindung Dihydrosorbicillacton A (3).
    [0047] Aufgrundder Tatsache, daß sichdie beiden Verbindungen lediglich im Sättigungsgrad an C-2' und C-3' in der Sorbylseitenketteunterscheiden, sind die physikalischen Eigenschaften der Moleküle, wieMasse oder Polarität,die man sich bei der Trennung von Substanzgemischen zu Nutze macht,nahezu identisch. Die Trennung kann aber durch Gelchromatographiean Sephadex-LH-20-Material mit Methanol als Eluent realisiert werden.Aufgrund der großen Ähnlichkeitder Moleküleist jedoch die Verwendung eines sehr langen Säulensystems (größer odergleich 6 m) nötig.Dieses Säulensystemwird als MPLC-System übereine Pumpe mit Lösungsmittelversorgt. Die Flußgeschwindigkeitdes Eluenten beträgtca. 10 mL pro min. Die beiden Lactone 2 und 3 werden dabei in ausreichenderWeise voneinander getrennt, wobei 3 schneller eluiert. Man erhält pro Trennungsgangca. 70 % des aufgetragenen, verunreinigten Sorbicillacton A (2)in sauberen Fraktionen. Die mit 3 verunreinigten Mischfraktionenkönnendurch erneute Chromatographie an Sephadex LH-20 problemlos nachgereinigtwerden.
    [0048] ZurBestimmung des prozentualen Verhältnissesvon Sorbicillacton A (2) und Dihydrosorbicillacton A (3) in denRohextrakten wird zunächsteine Probe des Extraktes mit einem Methanol/Wassergemisch verdünnt. DieProbe wird an einer analytischen HPLC mit Diodenarray-Detektor unterisokratischen Bedingungen (Wasser/Acetonitril/ TFA = 70/30/0,05%) an einer Waters Symmetry-C-18 reversed-phase-Säule beieinem Fluß von0,4 mL/min untersucht. Man erzielt so eine für die Integration der Peakflächen derVerbindungen ausreichende Trennung. Die Integration der Peakflächen wirddabei bei einer Wellenlängevon 220 nm durchgeführt, dadie Absorption der beiden Lactone (2, 3) bei dieser Wellenlänge etwagleich stark ist. Diese Methode kann auch zur Untersuchung der Reinheitder Fraktionen aus der Gelchromatographie herangezogen werden.
    [0049] ZurBeschleunigung der Analytik der Fraktionen aus dem letzten Aufreinigungsschrittwurde nach einer Methode gesucht, die ohne chromatographische Verfahrenauskommt. Dabei erwies es sich als praktikabel, die UV-Absorptionder entsprechenden Fraktionen sowohl bei 300 nm als auch bei 430nm aufzunehmen und den Quotient aus den beiden Messwerten zur Überprüfung derReinheit heranzuziehen. Die unerwünschte Verunreinigung DihydrosorbicillactonA (3) eluiert vor Sorbicillacton A (2) und absorbiert, wie auchSorbicillacton A (2), bei 300 nm stark, bei einer Wellenlänge von430 nm aber praktisch nicht. Bei Erreichen eines konstanten Quotientenaus den beiden Messwerten kann also davon ausgegangen werden, daß die Fraktionen lediglichsauberes Sorbicillacton A (2) enthalten. Diese Ergebnisse konntendurch Kontrollmessungen unter den bei Beispiel 8 beschriebenen Bedingungenbestätigtwerden. Die Messzeit fürdie Analytik aller Fraktionen einer Trennung kann so von mehrerenStunden bei der HPLC-Analytikauf nur wenige Minuten reduziert werden.
    [0050] DieDerivatisierung von Sorbicillacton A (2) zum Methylester 4 war zumeinem interessant, da sich die Verbindung als interner Standardzur Bestimmung der Konzentration in z. B. Blutserum eignet, zumanderen zur Betrachtung von Struktur-Aktivitätsbeziehungen. In 5 mL Methanolwurden 30 mg Sorbicillacton A (2) gelöst und mit 200 μL konzentrierterSchwefelsäureversetzt. Nach 6 Stunden Rührenbei Raumtemperatur wurden 100 mL Wasser zugegeben und das Gemischzweimal mit je 100 mL Ethylacetat extrahiert. Nach Eindampfen derorganischen Phasen im Vakuum wurde der Rückstand durch präparativeHPLC aufgereinigt. Man erhielt so 18,6 mg einer gelben amorphenSubstanz.
    [0051] Physikalischeund spektroskopische Daten von Sorbicillacton-A-methylester (4): DieVerbindung liegt als gelber amorpher Feststoff vor. Schmp.166–170 °C (THF). [α] 20 / D = –558° (c = 0,2in Methanol). CD (c = 0.2 in Methanol): Δε208 +11.1, Δε231 –12.6, Δε278 +12.5, Δε370 –13.0. IR(KBr): v = 3333 (br.), 2931 (w), 1783 (m), 1730 (m), 1681 (s), 1612(s), 1552 (s), 1442 (m), 1415 (m), 1384 (m), 1350 (s), 1310 (s),1198 (m), 1176 (m), 1065 (m) cm–1. MS(ESI, positiv): m/z 432 [M+H]+.
    [0052] Material:Es wurden die gleichen Materialien, wie in Perovic et al. (1998,Mech. Ageing Dev. 101:1–19) beschrieben,verwendet. Fura-2-Acetoxymethylester (Fura-2-AM) wurde von MolecularProbes (Leiden, Niederlande), „Dulbecco's modified Eagle's Medium" mit 4,5 g/L Glucose(DMEM/HG), L-Glutaminsäure(L-Glu) und Serotonin (5-HT) von Sigma- Aldrich (Taufkirchen, Deutschland) unddie AntikörperMäuse-Anti-Neurofilament(68 kDa) und Mäuse-Anti-Glial-Fibrillary-Acidic-Protein(GFAP) von Roche Diagnostics (Mannheim, Deutschland) bezogen. Eswurde Sorbicillacton A der Charge: 2208/2a verwendet.
    [0053] Primäre Neuronen:Die kortikale Zellkultur wurde aus den Gehirnen von 17–18 Tagealten Rattenembryonen nach einer modifizierten Prozedur erstellt[Freshney (1987) Culture of specific cell types. In: Culture ofAnimal Cells. A Manual of Basic Technique, A.R. Liss, New York,S. 257–288;Perovic et al. (1994) Eur. J. Pharmacol. (Mol. Pharmacol. Sec.)288:27–33].Nach der Isolierung wurden die Cerebral-Hemisphären in „Hank's Balanced Salt Solution" (HBSS) ohne Ca2+ und Mg2+ gelegtund anschließenddie neuronalen Zellen in HBSS mit Hilfe von 0,025 % (w/v) Trypsin(10 min.; 37°C)dissoziiert. Die proteolytische Reaktion wurde mit 10 % (v/v) fötalem Kälberserum(FKS) abgebrochen. Die Einzelzellsuspension wurde zentrifugiertund das resultierende Pellet in „Dulbecco's modified Eagles's Medium" mit 4,5 g/L Glucose (DMEM/HG) (enthält 2 mM L-Glutamin,100 mU/L Insulin und 10 % (v/v) FKS) aufgenommen. Die Zellen wurdenin eine mit Poly-L-Lysin (5 μg/mL,300 μl/cm2) beschichtete Kammer mit einer Zelldichtevon 2,0 × 105 Zellen/cm2 ausplattiert.Nach zwei Tagen wurde das DMEM/HG/10%-FKS-Medium entfernt und durchDMEM/HG/serumfreies Medium ersetzt. Zwei Wochen nach der Isolierungerfolgte die Immunfärbungmit Anti-Neurofilament(68 kDa) als Marker fürNeuronen und Anti-GFAP als Marker für Gliazellen. Die Kulturenbeinhalteten > 80% Neuronen; die restlichen 20 % waren GFAP-positive Zellen, hauptsächlich Astrozyten(Ushijima et al. (1995) Eur. J. Neurosci. 7:1353–9). Die Neuronen wurden ineiner Atmosphäreaus 95 % Luft und 5 % CO2 bei 37°C gehalten.
    [0054] Ladenvon Neuronen mit Fura-2-AM: Die intrazelluläre Ca2+-Konzentration([Ca2+]i) wurde durch Fluoreszenzmessungenbestimmt. Ausschlaggebend war das Verhältnis der Absorption des Ca2+-Indikatorfarbstoffes Fura-2-AM bei 340und 380 nm (Grynkiewicz et al. (1985) J. Biol. Chem. 260:3440–50). DieNeuronen wurden mit 6 μM Fura-2-AMin DMEM/HG/serumfreiem Medium (versetzt mit 1 % (w/v) bovinem Serumalbumin)bei 37°Cfür 60min beladen. Nach Inkubation wurden die Zellen zweimal mit Mediumgewaschen und weitere 45 min lang bei 37°C inkubiert. Diese Inkubationszeitist ausreichend, um die Neuronen zu beladen (inaktives Fura-2-AM)und den Acetoxymethylester (aktives Fura-2) zu hydrolysieren.
    [0055] Kalzium-Kalibrierungskurve:Eine Kalzium-Kalibrierungskurve wurde nach den Methoden von Grynkiewiczet al. (1985, J. Biol. Chem. 260:3440–50) erstellt. Fluoreszenzbilderwurden fürjeden Puffer bei 340 und 380 nm erhalten. Der Quotient aus den beidenFluoreszenzspektren (340/380 nm) wurde berechnet und als Kalibrierungskurvedargestellt. Der Quotient (340/380 nm [Ratio-Wert]) von 1,0 entspricht228 nM [Ca2+]i.
    [0056] Änderungendes Kalziumspiegels in Neuronen: In allen Versuchsansätzen wurdendie Zellen zuerst mit Fura-2-AM beladen und anschließend mitunterschiedlichen Substanzen (in Locke's Lösung;154 mM NaCl; 5,6 mM KCl; 3,6 mM NaHCO3;5,6 mM Glucose and 10 mM Hepes; pH 7,4; ohne CaCl2)stimuliert. Sorbicillacton A wurde mit einer Konzentration von 10mg/mL in 100 % (v/v) DMSO gelöstund bei –20°C gelagert. Neuronenwurden im ersten Ansatz 5 min mit 0,1 % (v/v) DMSO (Kontrolle) stimuliert;nach 10 min wurden 200 μML-Glutaminsäure(L-Glu), 200 μMSerotonin (5-HT) und 2,5 mM CaCl2 zu denZellen gegeben. Im zweiten Ansatz wurde die Auswirkung von L-Glu,5-HT und 2,5 mM CaCl2 auf den Kalziumspiegelvorinkubierter Neuronen (jeweils 5 min mit 10 μg/mL Sorbicillacton A) getestet.Der [Ca2+]i-Spiegelwurde in allen Experimenten mindestens 20–25 min lang gemessen.
    [0057] ZurBestimmung des [Ca2+]i wurdendie Zellen auf Poly-L-Lysin beschichteten Borsilikat-Deckgläsern im4-Kammer-System (Lab-Tek® Chamber SlideTM System; Nunc, Wiesbaden, Deutschland)kultiviert. Mit einem „inverted-stage"-Mikroskop (OlympusIX70) mit apochromatisch reflektiertem Licht und dem FluoreszenzobjektivUApo40X/340 wurden die Fluoreszenzmessungen durchgeführt. DieZellen wurden alternierend mit Licht der Wellenlängen 340 und 380 nm mit Hilfeeines computergesteuerten Schmalband-Interferenzfilters vor einer100-W-Xenon-Lampe beleuchtet. Zusätzlich wurde bei 380 nm ein0,25-ND-Filter benutzt. Die Fluoreszenzemissionen bei 510 nm wurdenmit einer CCD-Kamera (Modell C2400-87; Hamamatsu, Herrsching, Deutschland)aufgezeichnet. Die Bilder wurden computergestützt mit dem Imaging-SystemArgus 50, Hamamatsu, als 256 × 256Pixel mit 8-bit-Arrays digitalisiert. Der Fluoreszenzquotient 340/380nm wurde durch Division der Bilderpaare ermittelt.
    [0058] Statistik:Die Ergebnisse wurden mittels des gepaarten „Student's t-test" (Sachs (1984) Angewandte Statistik.Springer, Berlin) ausgewertet.
    [0059] Einfluß von SorbicillactonA auf den [Ca2+]i-Spiegelin neuronalen Zellen: Die Zugabe von 10 μg/mL Sorbicillacton A zeigtefast keinen Effekt auf [Ca2+]; in neuronalenZellen.
    [0060] Einfluß von L-Glutaminsäure auf[Ca2+]i-Spiegelin An- oder Abwesenheit von Sorbicillacton A in neuronalen Zellen:Inkubation der Zellen mit 200 μML-Glutaminsäure und2,5 mM Ca2+ (1A)ergab einen starken Anstieg von [Ca2+];nach 10 min. Am Ende der Messung stiegen die 340-/380-nm-Werte um1,715 ± 0,081 (307,1%). Die Kontrolle wurde dabei als 100% angenommen. Eine Präinkubationder Neuronen mit 10 μg/mL SorbicillactonA bewirkte einen Abfall des [Ca2+], Spiegelsnach der Zugabe von 200 μML-Glu und 2,5 mM CaCl2. Der Abfall im [Ca2+]i-Spiegel warsignifikant und betrug 46,7 % bei 10 μg/mL (p < 0,001, 1A).
    [0061] Einfluß von Serotoninauf [Ca2+]i-Spiegelin An- oder Abwesenheit von Sorbicillacton A in neuronalen Zellen:Zugabe von 200 μMSerotonin (5-HT) und 2,5 mM Ca2+ zu denZellen (1B) ergab einen starken Anstiegvon [Ca2+]; nach 10 min. Die 340-/380-nm-Wertestiegen um 0,971 ± 0,112(219,9 %). Die Kontrolle wurde dabei als 100 % angenommen. Die Abnahmeder freien Kalziumkonzentration in Neuronen nach Präinkubationmit 10 μg/mLSorbicillacton A und anschließenderInkubation mit 200 μMvon 5-HT war signifikant; im Vergleich zur Kontrolle waren die Werteum 77,6 % (1B) gesunken.
    [0062] Eswurde gefunden, daß Zellen,die mit Sorbicillacton A inkubiert wurden, nach Zugabe von L-Glutaminsäure undSerotonin (5-HT) einen starken Abfall des intrazellulären Kalziumspiegelszeigten. L-Glutaminsäureund Serotonin sind als Neurotransmitter in einer Reihe von neurodegenerativenErkrankungen etiologisch involviert. Aufgrund dieser Eigenschaftenkann Sorbicillacton A in der Behandlung der genannten Erkrankungenund der damit verbundenen Symptom-Komplexe verwendet werden.
    [0063] Material: „NormalMelting Agarose" (NMA,Kat.-Nr. 840041) und „LowMelting Agarose" (LMA,Kat.-Nr. 870081) wurden von Biozym (Hamburg, Deutschland), Tritonx-100 von Fluka (Buchs SG, Schweiz), RPMI1640-Medium, DMSO und EDTAvon Sigma-Aldrich (Taufkirchen, Deutschland), NaCl und Tris vonRoth (Karsruhe, Deutschland) sowie fötales Kälberserum (FKS) von Gibco (Karlsruhe,Deutschland) bezogen. Es wurde Sorbicillacton A der Charge: 2208/2averwendet.
    [0064] Zellen:Die Genotoxititätvon Sorbicilllacton A wurde an L5178Y Mäuselymphomazellen (ATCC CRL 1722)getestet. Wie beschrieben (Mülleret al., 1979, Cancer Res. 39:1102–1107) wurden die Zellen in RPM11640-Mediummit 10 mM Hepes, dem 10 % fötalesKälberserum(FKS) zugesetzt worden war, kultiviert. Als Inokulumskonzentrationwurde 104 Zellen/mL gewählt. Die Zellen wurden mit1, 3 und 10 μg/mLSorbicillacton A 4 und 24 Stunden lang inkubiert. Nach der Inkubationwurden die Zellen mit dem „Comet-Assay" untersucht.
    [0065] AlkalischeElektrophorese: Die Objektträger(Superfrost) wurden mit Aceton gereinigt. 1,0-prozentige „NormalMelting Agarose" (NMA)in 1 × PBSwurde aufgekocht und anschließendwurden etwa 600 μlAgarose auf einen Objektträgeraufgetragen. Die Objektträgerwurden kurz (~ 5 min) bei 50°Cgetrocknet und über Nachtbei Raumtemperatur gelagert. Danach wurde die 0,7-prozentige „Low MeltingAgarose" (LMA) indestilliertem Wasser zubereitet. Die zweite Schicht auf den Objektträgern bestandaus 200 μlLMA. Die Objektträger wurdenbei 4°C10 min lang inkubiert. Die 3. Schicht bestand aus 10 μl Zellsuspension(7 × 104 Zellen/mL) plus 60 μl LMA. Nach Inkubation mit SorbicillactonA wurden die Zellen einmal mit 1 × PBS gewaschen und bei 800 × g für 5 minbei 4°Czentrifugiert. Die Zellzahl wurde auf 7 × 104 Zellen/mLverdünnt.Nach dem Auftragen wurden die Objektträger 4°C 10 min lang inkubiert. Vorder Zell-Lyse wurde die letzte LMA-Schicht (~ 100 μl) aufgetragen.Die Lyse der Zellen erfolgte im Dunkeln durch Inkubation in Lyselösung (10mM Tris, 100 mM EDTA, 2,5 M NaCl; pH = 10) mit 10 % (v/v) DMSO und1 % (v/v) Triton x-100 für1 Stunde bei 4°C.Die Objektträgerwurden direkt aus der Lyse in die Elektrophorese-Kammer überführt undfür 20min im Elektrophorese-Puffer (30 mM NaOH, 1 mM EDTA; pH 13,8) inkubiert.Die Elektrophorese wurde konstant auf 0,75 V/cm (~ 300 mA) eingestellt,und unter Eiskühlungfür 30min durchgeführt.Zur Neutralisierung wurden die Objektträger 5 min mit Neutralisierungspuffer(400 mM Tris; pH 7,5) bei Raumtemperatur gewaschen und anschließend 5 min.mit 95 % Ethanol entwässertund im Dunkeln luftgetrocknet. Die Objektträger wurden mit 60 μl Ethidiumbromid-Lösung (20 μg/mL dest.Wasser) angefärbt,photographiert und ausgewertet. Die Werte sind als „Extenttail moment" angegeben(Bihari et al., 2002, Croatica Chemica Acta 75:793–804; Müller etal., 1979, Cancer Res. 39:1102–1107).Ein großerZahlenwert deutet daher auf eine hohe Desintegration der DNS inden Zellen hin. Bei normalen Zellen ergeben sich Werte um 0.
    [0066] Ergebnisse:Die Inkubation der L5178Y-Zellen mit 1, 3 und 10 μg/mL SorbicillactonA zeigte nach 4 Stunden (2A) keinesignifikanten Änderungdes „Extenttail moment". Beidiesen Konzentrationen induziert Sorbicillacton A keine DNS-Strangbrüche. Auchnach 24 Stunden Inkubation mit Sorbicillacton A konnten keine signifikanten Änderungendes „Extenttail moment" beiL5178Y-Zellen festgestellt werden (2B).
    [0067] Schlußfolgerung:Es wurde gefunden, daß Zellen,die mit Sorbicillacton A inkubiert wurden, nach der Zugabe von 1,3 und 10 μg/mLkeinen signifikanten Anstieg des „Extent tail moment" zeigten.
    [0068] Material:PicoGreen wurde von Molecular Probes (Leiden, Niederlande), RPM11640-Medium von Sigma-Aldrich(Taufkirchen, Deutschland), fötalesKälberserum(FKS) von Gibco (Karlsruhe, Deutschland) und schwarze Mikrotiterplatten(96-Well-Platten) von Nunc (Wiesbaden, Deutschland) bezogen. Eswurde Sorbicillacton A der Charge: 2208/2a verwendet.
    [0069] Zellen:Die Genotoxititätvon Sorbicilllacton A wurde an L5178Y Mäuselymphomazellen (ATCC CRL 1722)getestet. Wie beschrieben (Mülleret al., 1979, Cancer Res. 39:1102–1107) wurden die Zellen in RPM11640-Medium,dem 10 % fötalesKälberserum(FKS) zugesetzt worden war, kultiviert. Als Inokulumskonzentrationwurde 104 Zellen/mL gewählt. Die Zellen wurden mit1, 3, 10 und 30 μg/mLSorbicillacton A (1) 4 und 24 Stunden lang inkubiert. Nach der Inkubationwurden die Zellen mit dem "FastMicroassay" untersucht.
    [0070] „Fast Microassay": Die Methode wurdenach einer modifizierten Methode durchgeführt (Batel et al.,1999, Anal.Biochem., 270:195–200).Die Zellen wurden zweimal mit 1 × PBS gewaschen. Nach Zentrifugationwurde das Pellet in 1 × PBSaufgenommen und auf 104 Zellen/mL verdünnt. Inschwarze Mikrotiterplatten (96-Well-Platten, Nunc, Wiesbaden) wurdenje 25 μlder Zellsuspension (etwa 2,5 × 104 Zellen pro Well) vorpipetiert. In den Kontrollenbefand sich 25 μl1 × PBS.Danach wurden 25 μlLyselösung(7 M Harnstoff, 0,1 % (w/v) SDS, 0,2 M EDTA, pH = 10,0) mit PicoGreen(20 μl konz.PicoGreen pro 1 mL Lyselösung)in die Mikrotiterplatte pipettiert. Anschließend wurden die Zellen 40 minlang im Dunkeln bei Raumtemperatur lysiert. Nach der Inkubationerfolgt die Denaturierung (Entwindung) der DNS durch Zugabe derfrisch hergestellten alkalischen Lösung. Diese wird hergestellt,indem 20 mL 20 mM EDTA und 32 mL 20 mM EDTA/100 mM NaOH auf einenpH-Wert von 12,3 eingestellt werden. Die Messung erfolgte sofortin einem Fluoroscan bei einer Exzitationswellenlänge von 485 nm und einer Emissionswellenlänge von520 nm, alle 3 bis 5 min, insgesamt 20 min. lang. Die Ergebnissewurden als „StrandScission Factors" (Strangbruch-Faktoren,SSF) angegeben und nach einer Denaturierungszeit (Entwindungszeit)von 20 min nach der folgenden Gleichung berechnet: SSF = log (%dsDNS-Probe/% dsDNS-Kontrolle).
    [0071] Ergebnisse:Einfluß vonSorbicillacton A auf den SSF-Wert in L5178Y-Zellen: Die Zugabe von1, 3, 10 und 30 μg/mLvon Sorbicillacton A zeigte fast keinen Effekt auf die SSF-Wertein L5178Y-Zellen nach 4 Stunden Inkubation (3A).
    [0072] Einsignifikanter Anstieg der SSF-Werte (Anteil an DNS-Strangbrüchen) wurdenach 24 Stunden bei Zugabe von 3 und 30 μg/mL (p < 0,001) Sorbicillacton A beobachtet(3B). Inkubation der L5178Y-Zellen mit1 bis 10 μg/mLSorbicillacton A zeigte einen leichten, aber keinen signifikantenAnstieg der SSF-Werte.
    [0073] Schlußfolgerung:Sorbicillacton A induziert in L5178Y-Zellen nach 24 Stunden Inkubationbei einer Konzentration von 30 μg/mLDNS-Strangbrüche.Aufgrund dieser Eigenschaften kann Sorbicillacton A in der Behandlungvon Leukämieangewendet werden.
    [0074] Material:RPM11640-Medium, Hepes gepuffert, wurde von Sigma-Aldrich (Taufkirchen,Deutschland), fötalesKälberserum(FKS) von Gibco (Karlsruhe, Deutschland) und Cell Death DetectionELISA plus von Roche (Mannheim, Deutschland, Cat.No. 1774425) bezogen.Es wurde Sorbicillacton A der Charge: 2208/2a verwendet.
    [0075] Inkubationund Aufarbeitung der Zellen: Die L5178Y- Mäuselymphomazellen (ATCC CRL1722)) wurden gezähltund auf eine Zellzahl von 104 Zellen/mLeingestellt. Die Sorbicillacton-A- und Dihydrosorbicillacton-A-Stammlösung (10mg/mL in DMSO) wurde mit Medium (RPMI/Hepes mit 10 % FKS) auf Konzentrationenvon 60, 20 und 6 μg/mLverdünnt.In einer 96-Well-Kulturplatte wurden zu je 100 μl der verschiedenen Dihydrosorbicillacton-A-und Sorbicillacton-A-Lösungenje 100 μlZellsuspension (~ 103 Zellen) pipettiert.Als Negativ-Kontrolle wurde RPM11640-Medium ohne Dihydrosorbicillactonund Sorbicillacton A verwendet. Die Endkonzentrationen betrugen30, 10 und 3 μg/mLSorbicillacton A und Dihydrosorbicillacton A Es wurden je vier Parallelansätze untersucht.Die Zellen wurden 4 Stunden bei 37°C inkubiert. Nach der Inkubationwurde die Kulturplatte bei 200 × g(~ 1200 rpm) 10 min lang bei Raumtemperatur zentrifugiert. Der Überstandwurde vorsichtig abpipettiert und die Zellen wurden mit je 200 μl Lysis-Puffer(Roche-Kit) überschichtet.Anschließend wurdensie 30 min lang bei Raumtemperatur lysiert. Nach der Lyse wurdedie Kulturplatte erneut bei 200 × g (~ 1200 rpm) 10 min langbei Raumtemperatur zentrifugiert.
    [0076] ELISA:Der Streptavidin-ELISA-Platte des Roche-Kits wurden zwei Stripsmit je acht „Wells" entnommen. In jedes „Well" wurden 20 μl des Überstandeseiner Zell-Lyse (siehe oben) gegeben. Dabei wurden die Proben mit30 bzw 10 μg/mLSorbicillacton A und Dihydrosorbicillacton A als 4-fach, alle anderenals Doppelbestimmungen aufgetragen. Zusätzlich zu diesen Proben wurdeeine Positiv-Kontrolle (DNS-Histon-Komplex) aufgetragen. In jedes „Well" wurden dann 80 μl Immunreagenzgegeben. Diese Lösungsetzte sich aus Inkubationspuffer, Anti-Histon-Biotin und Anti-DNS-Peroxidase zusammen.Als Leerwert wurde der Inkubationspuffer verwendet. Die ELISA-Plattewurde 2 Stunden im Schüttelinkubatorbei Raumtemperatur inkubiert. Danach wurden die Überstände vorsichtig entfernt unddie „Wells" 3 × mit je250 μl Inkubationspuffergewaschen. Nach dem Waschen wurden in jedes „Well" 100 μlABTS-Lösung zugegeben.Anschließendwurden die Zellen 30 min lang im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubiert.Die Messung erfolgte in einem Multiscan bei einer Emissionswellenlänge von405 nm.
    [0077] Ergebnisse:Zugabe von 3 μg/mLSorbicillacton A zu den Zellen (Tabelle 2) ergab nach 4 StundenInkubation keinen Anstieg an Apoptose-Zellen. Die Werte 91,2 % liegenim Bereich der Negativ-Kontrolle (= 100%) (Tabelle 2). Tabelle2.
    [0078] Nachder Inkubation (4 Stunden) der L5178Y-Zellen mit 10 und 30 μg/mL SorbicillactonA stiegen die Werte signifikant auf 283,8 % und 322,1 % (p < 0,001, Tabelle2). Die Negativ-Kontrolle wurde dabei als 100% angenommen. Tabelle3.
    [0079] DieZugabe von 3, 10 und 30 μg/mLDihydrosorbicillacton A zeigte nach 4 Stunden Inkubation bei L5178Y-Zellenkeine Induktion von Apoptose (Tabelle 3). Die Werte waren unterden Kontrollbereich auf 62 bis 67 % gesunken.
    [0080] Schlußfolgerung:Sorbicillacton A induziert in L5178Y-Zellen nach 4-Stunden-Inkubation bei einer Konzentrationvon 10 und 30 μg/mLApoptose. Aufgrund dieser Eigenschaften kann Sorbicillacton A inder Behandlung von Leukämieverwendet werden. Dihydrosorbicillacton A induziert unter den gewählten experimentellenBedingungen keine Apoptose bei L5178Y-Zellen.
    权利要求:
    Claims (27)
    [1] Verfahren zur Herstellung von SorbicillactonA oder Derivaten davon, umfassend die Schritte von: a) Anzüchten einesPilzes der Gattung Penicillium bei 20–25 °C in einem geeigneten Anzuchtmediumbei einer Salzkonzentration von 2–5 % bis zum Ausbilden eineskompakten Oberflächenmycels, b)Erhöhender Temperatur auf 28–35°C und weiteresInkubieren für5–10 Tage, c)Abtrennen der Kulturflüssigkeitvom Mycel, und d) Extrahieren von Sorbicillacton A und Derivatendavon aus dem Kulturmedium, und gegebenenfalls, e) Unterschichtendes Mycels mit frischem Medium mit einer verringerten Salzkonzentrationvon 0,5–1,5% und Inkubieren bei 28–35°C für 3–8 Tage, f)Wiederholen von Schritt c) und d), und gegebenenfalls, g) Wiederholender Schritte e) bis f), und h) Extrahieren von SorbicillactonA und Derivaten davon aus dem Kulturmedium und/oder den Mycelien.
    [2] Verfahren nach Anspruch 1, wobei es sich bei demPilz um Penicillium chrysogenum handelt, insbesondere der StammKIP 3201.
    [3] Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobeiverschiedene Additiva den geeigneten Anzuchtmedien zugesetzt werdenkönnen,wie z.B. Pyruvat, Glutamat, Prolin, Acetat, Sorbicillin oder andere biosynthetischeVorstufen von Sorbicillacton A.
    [4] Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobeidie Produktion im Flachbettverfahren erfolgt.
    [5] Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobeies sich beim Inokulum um eine Festkörper-gebundene Form des Pilzeshandelt.
    [6] Verfahren nach Anspruch 5, wobei es sich bei denFestkörpern,an die der Pilz gebunden ist, um schwimmfähige Festkörper, z.B. Getreidekörner oderStyroporkugeln, handelt.
    [7] Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobeieine Trägervorrichtungzur Stabilisierung des Oberflächenmycelsin den Anzuchtbehältereingeführtwird.
    [8] Verfahren nach Anspruch 7, wobei es sich bei derTrägervorrichtungum ein Netz handelt.
    [9] Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobeiSorbicillacton A oder Derivate davon aus dem vom Kulturmedium abgetrenntenPilzmycel durch Versetzen mit Ethylacetat extrahiert werden.
    [10] Verfahren nach einem der Ansprüche 1–8, wobei Sorbicillacton Aoder Derivate davon aus dem Kulturmedium unmittelbar an einen festenAustauscher gebunden und aus dieser gebundenen Form weiter aufgereinigtwerden.
    [11] Verfahren nach Anspruch 10, wobei es sich bei demfesten Austauscher um das Austauschharz Amberlite XAD-16 handelt.
    [12] Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, wobei der beladenefeste Austauscher aus dem Medium abfiltriert wird und SorbicillactonA oder Derivate davon mit organischen Lösungsmitteln eluiert werden.
    [13] Verfahren nach Anspruch 12, wobei es sich bei denorganischen Lösungsmittelnum Methanol, Ethanol, Ethylacetat, Heptan oder Acetonitril handelt.
    [14] Verfahren nach einem der Ansprüche 10–13, wobei Sorbicillacton Aoder Derivate davon aus dem Rohextrakt mit organischen Lösungsmittelnsauer extrahiert werden.
    [15] Verfahren nach Anspruch 14, wobei der Rohextraktmit Phosphorsäureauf pH 2 gebracht und anschließendmit Ethylacetat extrahiert wird.
    [16] Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobeieine Aufreinigung der Extrakte mittels FCPC (Fast Centrifugal PartitioningChromatography) erfolgt.
    [17] Verfahren nach Anspruch 16, wobei ein Lösungsmittelgemischaus Heptan, Ethylacetat, Methanol und Wasser mit einem Zusatz von1 ml/l konzentrierter Phosphorsäurebei einem Fluß von6–7 ml/minund einer Umdrehungszahl von 1200 Umdrehungen pro min und wobeidie obere als stationärePhase angewendet wird.
    [18] Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobeieine Aufreinigung der Extrakte durch Gelchromatographie an SephadexLH-20 unter Verwendung eines organischen Lösungsmittels erfolgt.
    [19] Verfahren nach Anspruch 18, wobei SorbicillactonA mit Methanol eluiert wird.
    [20] Verfahren zur Herstellung von Sorbicillacton-A-methylesterumfassend die Schritte von: a) Herstellen von SorbicillactonA wie in den Ansprüchen1–19 beschrieben, b)Versetzen von in Methanol gelöstemSorbicillacton A mit konzentrierter Schwefelsäure, c) Rühren beiRaumtemperatur für6 h, d) Zugeben von Wasser, e) Extrahieren mit Ethylacetat, f)Eindampfen der organischen Phasen im Vakuum, und g) Reinigendes Rückstandesdurch präparativeHPLC.
    [21] Verfahren zur Herstellung eines Pharmazeutikumsumfassend die Schritte von: a) Herstellen von SorbicillactonA oder Derivate davon wie in den Ansprüchen 1–19 beschrieben, und b)Formulieren einer pharmazeutischen Zusammensetzung unter der Verwendungpharmazeutisch akzeptabler Hilfs- und Zusatzstoffe.
    [22] Verfahren zur Herstellung eines Pharmazeutikumsnach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß Sorbicillacton A oder Derivatedavon in einer Menge vorliegen, daß ein Konzentrationsbereichzwischen 0,3 und 30 μg/mlbei der Behandlung in vivo vorliegt.
    [23] Verwendung von Sorbicillacton A oder Derivaten davonals Auslöservon Apoptose in erkrankten Zellen, insbesondere Tumorzellen.
    [24] Verwendung von Sorbicillacton A oder Derivaten davonbei der Behandlung von Leukämie.
    [25] Verwendung von Sorbicillacton A oder Derivaten davonbei der Behandlung neurodegenerativer Erkrankungen.
    [26] Verwendung von Sorbicillacton A oder Derivaten davonbei der Behandlung bakterieller und fungaler Infektionen.
    [27] Pilzstamm der Gattung Penicillium chrysogenum KIP3201, mit der Hinterlegungsnummer DSM 16137.
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    同族专利:
    公开号 | 公开日
    US20070135515A1|2007-06-14|
    DE102004004901B4|2006-01-05|
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    WO2005072711A2|2005-08-11|
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    引用文献:
    公开号 | 申请日 | 公开日 | 申请人 | 专利标题
    法律状态:
    2005-08-25| OP8| Request for examination as to paragraph 44 patent law|
    2006-06-29| 8364| No opposition during term of opposition|
    2009-11-19| 8339| Ceased/non-payment of the annual fee|
    优先权:
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